远隔缺血后适应对HIE大鼠链每父感受体表达和 Akt/Pi3k通路的影响

来源: 未知 作者:paper 发布时间: 2020-04-08 11:03
论文地区:中国 论文语言:中文 论文类型:医学论文
目的:建立缺氧缺血性脑病(Hypoxic Ischemic Encephalopathy, HIE)模型与远隔缺 血后适应(Remote Ischemic Post-Conditioning, RIPC)模型,观察 RIPC 对新生大鼠 HIE 的保护作用,探讨远隔缺血后适应对
目录
商要 1
二> Abstract 3
三、 前言 5
四、 文献综述 7
五、 材料与方法 14
六、 结果 18
七、 讨论 29
八、 结论 33
摘 要
目的:建立缺氧缺血性脑病(Hypoxic Ischemic Encephalopathy, HIE)模型与远隔缺 血后适应(Remote Ischemic Post-Conditioning, RIPC)模型,观察 RIPC 对新生大鼠 HIE
的保护作用,探讨远隔缺血后适应对HIE大鼠脑组织钙敏感受体(Calcium Sensing Receptor, CaSR)的表达和丝氨酸苏氨酸蛋白激酶/磷酸肌醇3-激酶(Serine/threonine protein Kinase/phosphoinositol 3-kinase,Akt/Pi3k)信号通路的影响。
方法:7日龄新生Wistar大鼠120只随机分为:假手术组(S组:只做双侧颈总动 脉游离处理)、缺氧缺血性脑病组(HIE组:进行双侧颈总动脉结扎及缺氧处理60 min)、远隔缺血后适应5 min组(R1组:大鼠在完成缺血及缺氧处理后立即进行3个 循环的双侧下肢5 min缺血/5 min再灌注)、远隔缺血后适应10 min组(R2组:大鼠 在完成缺血及缺氧处理后后立即给予3个循环的双侧下肢10 min缺血/10 min再灌 注)。R1组、R2组在缺氧缺血性脑病模型建立后连续5日分别给予5 min周期、10 min周期的远隔缺血后适应处理。观察各组大鼠的行为表现、体重增长情况、脑组织病 理学形态变化和神经元细胞超微结构改变,免疫组织化学染色法检测0&511、:6&^:6〇1-
2、p-Akt、Akt蛋白的表达程度,免疫印迹法检测p-Akt、Bax、Bcl-2蛋白的表达情 况。
结果:与S组相比较,HIE组大鼠出现头部震颤、走路不稳、翻身能力差等行为异 常表现;与HIE组大鼠相比,R1组与R2组大鼠的精神状态、平衡及翻身能力均有所 改善,肢体抖动症状减轻。7日龄所有大鼠体重差异不明显(尸>0.05) ; 12日龄时,S 组大鼠体重显著大于HIE组、R1组、R2组3组大鼠的体重(尸<0.05) ; HIE组、R1 组、R2组3组间大鼠体重大小比较无统计学意义(P>0.05)。HIE组大鼠体重增长率 明显小于S组(尸<0.05) ; R1组和R2组体重增长率明显高于HIE组(尸<0.05) ; S 组大鼠脑皮质及海马区细胞形态及结构正常,排列整齐有序;HE组细胞杂乱分布,结 构缺失,溶酶体增多,线粒体水肿,细胞破损严重;R1组与R2组神经元细胞排列较 HIE组整齐,细胞水肿程度减轻、结构损伤减轻。HIE组CaSR、Bax蛋白较S组表达 明显增加(PC0.05),p-Akt、Bcl-2蛋白较S组表达明显减少(P<0.05) ; R1组与
R2组CaSR、Bax蛋白较HIE组表达明显减少(尸<0.05),p-Akt、Bcl-2蛋白较HIE 组表达明显增加(P<0.05) ; R1组和R2组,各项指标差异不明显(尸>0.05)。
结论:RIPC能使HIE大鼠脑组织内的CaSR异常表达受到抑制、激活Akt/Pi3k通 路并上调p-Akt的表达,保护受损脑组织;RIPC通过促进Bcl-2家族成员Bcl-2表达同 时降低Bax表达,参与保护受损神经元细胞,起到脑保护作用;5 min周期的重复RIPC 可对HIE产生明显保护作用,且5 min周期与10 min周期RIPC对脑的保护作用无明显 差异。





缺氧缺血性脑病(Hypoxic Ischemic Encephalopathy, HIE)大多是新生儿在出生前、
后或出生时多种原因导致脑组织发生缺氧、缺血性损害后引起的损伤,患儿可表现出多 种神经性脑病症状,该病增加了新生儿死亡率及遗留脑性瘫痪、癫痫发作等后遗症的风 险[1_3]。随着医学诊疗技术的提升,多种产前、产时或产后因素所致的高危儿存活率上 升,新生儿发生脑损伤的概率增加,研究表明:发达国家HIE的发病率约为活产婴儿 1-8%〇,发展中国家的发病率现已占活产婴儿的26%〇[4,5]。长期随访研究发现,早期发现 新生儿HE,并进行早期适当治疗及后续康复治疗是非常有必要的[6]。现在临床上治疗 新生儿缺氧缺血性脑病尚无明确、统一的治疗方案,探求积极、安全、有效的治疗方案 减轻HIE脑损伤是长久以来专家学者的研究热点。
近年来,远隔缺血后适应(Remote Ischemic Post Conditioning, RIPC)作为一种新型 临床诊疗策略在减轻缺血性疾病的损伤中取得较好地疗效[7,8]。RIPC X寸脑的保护作用主 要表现在减少脑梗死面积、抑制神经元细胞凋亡、改善神经功能等方面。多年以来,经 过众多研究学者不断地探索、研究、改进,发现与缺血预处理、缺血后处理比较, RIPC是一种更为安全、有效、可行的减轻缺血性疾病致组织器官损伤的诊疗策略[9]。 2009年,Ren等在局灶性脑缺血模型中首次证实RIPC能有效降低脑梗死面积、改善神 经功能[1()]。随后大量动物实验证实了 RIPC显著、有效的脑保护作用,可通过提高机体 抗氧化损伤能力、促进神经元存活、激活/抑制细胞信号通路、减轻血脑屏障损伤、减 轻缺血/再灌注损伤等发挥其保护作用[11_16]。RIPC的脑保护作用不仅在动物研究中得到 证实,在临床试验治疗缺血性脑卒中同样取得了较好的疗效[8]。
隹丐敏感受体(Calcium Sensing Receptor, CaSR)属于G蛋白偶联受体C家族一员, 在心、脑、乳腺、甲状腺等全身多种组织细胞中有不同程度的表达,除调节机体钙平 衡,在興代谢方面起重要作用外,在细胞增殖、存活、凋亡与激素分泌等细胞活动过程 中同样发挥了重要作用[17_2()]。此外,CaSR在器官缺血性损伤发生与发展的过程中占有 重要角色,Wang等研究发现,诱导离体心肌细胞损伤可激活CaSR,使其表达上调,

促进了钙离子的释放,增加了心肌细胞内钙离子浓度,加重细胞损伤同时促进细胞凋 亡;CaSR激动剂可进一步加重心肌细胞损伤,而应用CaSR拮抗剂可降低细胞内钙离 子浓度,降低促炎因子水平,促进细胞存活,对心肌产生保护作用[21]。随着对CaSR研 究的深入,发现CaSR在大脑的许多区域中都有表达,脑缺血损伤后激活CaSR,促进 神经元细胞凋亡,加重脑组织损伤[19]。
丝氨酸苏氨酸蛋白激酶/磷酸肌醇3-激酶(serine/threonine protein kinase / phosphoinositol 3 kinase,Akt/Pi3k)信号转导途径(通路)在许多病理生理过程中起到
关键作用,其中在参与调控细胞凋亡与存活方面的作用尤为显著[22,23]。大量动物实验证 实,Akt/Pi3k信号转导途径在大鼠脑缺血时发挥了强有力的神经保护作用,缺血可通过 激活该通路,使Akt发生磷酸化活化后通过调控下游靶蛋白降低神经元细胞凋亡率,减 轻脑组织缺血性损伤[24’25]。在新生大鼠HE模型中,调节并激活Akt/Pi3k信号转导途径 能对脑组织产生积极有效地保护作用[26]。
本研究通过建立缺氧缺血性脑病模型,给予双下肢连续5日5 min周期与10 min周 期的重复远隔缺血后适应,观察神经行为和体重变化情况,采用HE染色、电镜检测观 察RIPC对HIE大鼠脑组织形态学变化及皮质神经元细胞超微结构的影响,免疫组化法 和免疫印迹法测量脑组织CaSR、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2的表达程度,观察RIPC在 新生大鼠HIE模型中神经保护作用,初步探讨RIPC对HIE大鼠的保护机制。







文献综述
一、远隔缺血后适应
2005年,Kerendi等人率先证实通过对远隔器官进行缺血后处理可明显缩小心肌梗 死范围,给受损心肌提供明显有效的保护作用,远隔缺血后适应(Remote Ischemic Post Conditioning, RIPC)概念随之被提出,在心、脑等组织器官因血管阻塞、夕卜伤等多种原 因导致组织器官血液供应中断发生缺血损伤后,对肾、肠和四肢等远端器官实施缺血后 处理可给予缺血的脏器带来强有力的保护[27]。众所周知,组织器官发生缺血,在恢复血 流灌注过程中,不仅不能减轻组织损伤,反而会引起炎症反应、氧化应激、激活细胞凋 亡通路,再灌注加重组织器官损伤[28]。许多实验结果证实,组织器官缺血后再对其进行 短暂的缺血刺激,从而使机体对缺血有一定的耐受能力,器官损伤减轻的同时可促进器 官功能恢复,由于是在缺血原位器官进行,操作复杂、有二次损伤的风险,尤其对心和 脑来说,风险较大,不便于临床治疗过程中使用[29]。随着研究的深入,研究学者致力于 RIPC在脑损伤方面的研究,2009年,Ren等首次研究RIPC对脑缺血损伤大鼠是否具 有作用,结果表明脑缺血模型大鼠经过对单侧股动脉实施15 min周期的RIPC:,脑梗死 面积较对照组明显减少,神经行为表现明显优于对照组,证实RIPC X寸脑损伤有显著地 保护作用[1()]。近年来研究发现,RIPC不仅对成熟脑损伤具有保护作用,对HIE大鼠同 样具有脑保护作用,且能改善HIE大鼠远期运动功能,进一步表明RIPC具有远期神经 保护作用,对于改善HE长期神经功能缺陷意义重大[3()_33]。
1.RIPC的神经保护机制 1.1减少氧化应激
神经元细胞与心肌细胞同样具有对缺氧缺血耐受性较差的特点,缺氧缺血可导致脑 内氧自由基及活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)含量增多,清除ROS能力下降, 破坏了抗氧化防御机制,刺激氧化应激反应的发生,致使细胞损伤加重、细胞凋亡率上 升[34]。抑制机体合成、释放ROS和自由基增加机体清除氧自由基及活性氧能力和抗
氧化能力可对机体起到积极有效的保护作用。蛋白激酶C参与调控细胞病理生理过程,
5蛋白激酶C可加重细胞损伤,抑制其表达,可对细胞起到保护作用。研究发现,脑缺 血早期对股动脉实施循环3次10 min周期的RIPC:,可抑制ROS介导的内源性S蛋白激 酶C级联反应,通过阻断凋亡通路,发挥保护作用[35]。除此以外,RIPC还可上调超氧 化物歧化酶(Super Oxide Dismutases,SOD)的活性、减少丙二醛(Malondialdehyde, MDA) 的形成,增加机体脑组织对抗氧化应激损伤水平,减轻组织损伤[11,12]。内皮型一氧化氮 合酶(Endothelial Nitric Oxide Synthase, eNOS)对 NO 的合成具有重要作用,eNOS 解 偶联导致NO合成减少,增加了细胞凋亡率,而RIPC能逆转eNOS解偶联,可提升神 经元细胞存活率,发挥神经保护作用[36]。
1.2抑制炎症反应
肿瘤坏死因子-a (Tumor Necrosis Factor-a,TNF-a)和白细胞介素-6 (Interleukin,IL-
6)等炎性介质促进了缺血性脑损伤的发生与发展,引发的炎症反应加重了神经元细胞 的损伤[3738]。王宁等通过对大脑中动脉阻塞模型大鼠实施循环3次的15 min周期的 RIPC,发现RIPC可明显下调IL-ip、IL-6, TNF-a以及单核细胞趋化蛋白-1等促炎性 反应介质的含量,从而增加机体抗炎能力并减轻炎症反应和脑组织损伤[39]。另外, RIPC不仅可以降低脑组织炎性介质TNF-a水平,还可以增加HO-1及BDNF的表达, 使得脑组织抗氧化能力提升,炎症反应减轻,促进神经元细胞存活[4()]。刘强等通过对脑 缺血模型大鼠进行RIPC处理发现,RIPC可通过抑制促炎症反应因子表达,并促进抑制 炎症因子表达,提高细胞存活率,减轻脑损伤[41]。常丽莎等研究报道,无论是大脑原位 缺血后适应还是RIPC都能降低炎性介质超敏C反应蛋白(Hypersensitive c-reactive protein,hs-CRP)的表达,通过提高机体抗炎水平,减轻脑组织损伤[42]。
1.3抑制细胞凋亡
脑缺血可刺激机体启动应激反应,随着脑内兴奋性氨基酸、细胞内钙离子和促进炎 症反应物质的在脑内不断地累积,促进了脑缺血性损伤加重[4345]。Gao等通过对脑缺血 大鼠模型进行双下肢循环3次的10 min周期RIPC,结果发现RIPC可通过阻断凋亡途 径,减轻神经元细胞损伤同时对脑功能的恢复起到很好地促进作用[13]。另外,动物研究 发现RIPC组大鼠和对照组大鼠相比脑内Bd-2蛋白水平上调、Bax蛋白与对照组相比 表达受到抑制,表明RIPC可影响Bcl-2、Bax蛋白的表达水平,保护受损神经元,X寸脑
组织具有保护作用[41]。Chen等在进行RIPC对脑缺血模型大鼠脑保护作用研究时发现, 给予双下肢循环3次15 min周期RIPC后相关信号转导途径被激活,可下调过度自噬所 致细胞凋亡,X寸脑功能的恢复具有促进作用[15]。Li等在研究RIPC对缺血性脑卒中的作 用时发现,RIPC可减轻血脑屏障损伤,促进神经元细胞存活,起到神经保护作用[16]。
2.RIPC实施方式
远隔缺血后适应是研究学者在缺血预适应及后适应的基础上经过不断地研究、改进 地更为安全、有效、便捷的减轻缺血性损伤的新型诊疗策略。器官发生缺血性损伤后, 在远隔肢体或其他器官进行阻断血流/恢复血液灌注的循环刺激,可有效降低缺血的原 位生命重要器官发生二次损伤的风险[46]。以往实施RIPC的方法主要有反复夹闭股动 脉、夹闭肠系膜上动脉等,由于其具有有创性,临床应用受到限制。目前主要釆取无创 止血带结扎法(止血带阻断双下肢股动脉血流),该方法更为安全、有效,操作简单, 增加了其临床可行性。在脑缺血发生后早期对大鼠肢体进行10 min周期的RIPC:,发现 RIPC可调节GSK-3P/CREB/BDNF通路,提高机体抗氧化水平,减轻脑组织损伤,有利 于脑功能的恢复[47]。此外,还有研究发现,X寸脑缺血大鼠实施无创RIPC,早期(24小 时内)RIPC可得到短暂的神经保护,延迟(5日)RIPC可在长期内改善神经功能[48]。 何君艺等通过对在体脑缺血模型研究发现,对脑缺血模型鼠进行双下肢RIPC,可促进 脑功能恢复,有效减轻缺血性神经损伤[49]。
3.RIPC脑保护作用的临床应用
先前众多动物实验结果均证实远隔缺血后适应可对脑组织产生明显有效的影响,随 后RIPC逐渐转向治疗缺血性疾病并取得令人满意的效果。梁可可等将RIPC用于急性 脑梗死患者临床治疗,参与研究的急性脑梗死患者被随机分为RIPC组和对照组分别采 用常规药物治疗联合RIPC和常规药物治疗,两周后检测患者血清HSP-27、HSP-70水 平,结果发现RIPC联合药物治疗能短期内上调患者血清HSP-27、HSP-70水平改善患 者认知水平,治疗90日后随访结果表明,RIPC能改善患者NIHSS评分并促进脑功能 的恢复[5()]。黄颖媚等对120名急性脑梗死患者进行研究发现,实验组连续3日给予5 min周期的短暂RIPC,结果发现:RIPC组患者的SOD活力增加,MDA含量减少, NIHSS评分降低,表明RIPC可提高患者机体抗氧化损伤能力,减轻缺血带来的脑损伤 [51]。王爽等通过对急性脑梗死患者进行为期1周的RIPC治疗,发现RIPC可上调IL-
2、IL-4及IL-10的水平,表明RIPC可能通过提升机体免疫状态,从而更好的发挥神经 保护作用[52]。何洁等分别在治疗前后为所有参与实验的脑卒中患者行SPECT检查评估 患者脑代谢及血流情况,结果发现实验组患者经RIPC连续治疗6个月后脑组织对缺血 的耐受性增加,患者脑血流灌注明显改善[53]。王心颖等对脑缺血患者连续12个月进行 RIPC治疗,经SPECT检查,得出与先前研究一致的结果,进一步证实RIPC X寸脑缺血 患者脑侧支循环建立和脑功能恢复的促进作用[54]。上述临床研究证实,无论是短暂一次 RIPC还是重复长期RIPC均能不同程度的增加脑部供血、改善神经功能,减轻缺血/再 灌注损伤,发挥其脑保护作用。
二、缺氧缺血性脑病
1.缺氧缺血性脑病概述
缺氧缺血性脑病(Hypoxic Ischemic Encephalopathy, HIE )多数情况下是因为患儿大
脑在母体内或出生时或出生后受到缺氧缺血性损害,临床上可表现为神经功能缺损等一 系列脑病,近年来在活产儿中的发病率呈上升趋势,发展中国家发病率高达 26%。[5,55,56]。目前针对11正所致的脑损伤及所遗留的脑瘫、癫痫等后遗症尚无完善治疗 方法,因此探索更为有效的治疗策略,积极预防后遗症的发生是非常必要的。
2.HIE的治疗
当下,针对HE所带来的脑损伤除了一般对症处理及药物疗法还有:高压氧治疗、 亚低温治疗等,虽然上述治疗方案能够一定程度上降低死亡率、改善患儿临床症状,但 上述治疗策略由于其自身的限制性均不能阻止HE后遗症的发生,因此,亟需寻求新的 治疗策略更好地改善患儿临床症状及预后。
3.HIE 与 RIPC
大量研究证实RIPC不仅在成年动物脑缺血模型中发挥强大有效的脑保护作用,在 成人脑缺血性疾病患者的临床治疗中同样取得较好的效果。随着RIPC强大显著地对抗 组织损伤的能力被不断证实,一些研究学者开始着眼于探寻RIPC在新生儿HE脑损伤 中的作用,将RIPC脑保护作用的研究由成年脑转向新生脑。目前RIPC在HIE方面的 研究较少,己有的基础动物实验结果显示RIPC对HIE的保护作用是明显有效的。Zhou 等发现,在10日龄新生大鼠脑组织HIE脑损伤后对其下肢进行循环4次10 min周期的 RIPC,结果显示,RIPC组大鼠脑损伤较HIE组明显减轻,脑功能优于HIE组,证实
RIPC对HIE具有保护作用[57]。另有研究证实,缺氧缺血24小时后分别对大鼠实施一次 RIPC治疗、及连续三次RIPC治疗,5周后检测发现,RIPC在HIE大鼠感觉运动及学 习记忆功能的恢复方面具有显著有效的积极作用,且认为连续三次治疗改善更为明显, 结果表明一次RIPC与连续三次RIPC均可长期改善新生儿脑缺氧缺血后的神经功能, 且连续治疗的效果更佳[33]。研究发现,缺氧缺血后立即给予远隔缺血后适应不仅可有效 地改善大鼠行为学表现,减少脑梗死面积,降低细胞凋亡水平,改善脑血液灌注,还对 其脑白质有保护作用[583]。
三、钙敏感受体
钙敏感受体是可表达在多种组织细胞中的跨膜受体,也是G蛋白偶联受体家族一 员,还是细胞外Ca2+的主要转导途径[17,6()]。经过多年深入研究发现,CaSR在大脑多个 区域都有不同程度的表达,尤其在未成熟脑发育过程中呈现高表达状态,对机体生长发 育过程极为重要[61,62]。CaSR通过传递细胞外信号,激活相关信号传导通路,维持钙平 衡,调节细胞多项活动过程,细胞凋亡、代谢、增殖均与CaSR联系密切[63,64]。在大多 数情况下,G蛋白-PLC-IP3信号通路是CaSR的主要调节通路,经过级联反应促使Ca2+ 浓度升高可引起应激反应,并通过下游相关信号通路,加重细胞损伤,导致细胞存活率 下降。Wang等在LPS致离体心肌细胞损伤的研究中发现,与对照组相比较CaSR激动 剂组进一步降低了细胞存活率,降低细胞抗氧化损伤能力,表明CaSR表达增加可心肌 细胞损伤,诱导细胞死亡[21]。以往研究证实CaSR对调节脑损伤过程细胞存活与凋亡具 有重要意义,Xue等通过建立创伤性脑损伤大鼠模型发现CaSR拮抗剂NPS2390 X寸脑损 伤具有保护作用,可减轻细胞损伤,促进脑功能的恢复[19]。CaSR过度表达可导致组织 损伤加重,而抑制CaSR表达可对脑组织起到保护作用,因此抑制钙敏感受体过度表达 对于治疗缺血性疾病是非常有必要的。

四、Akt/Pi3k信号通路
Akt/Pi3k信号转导途径(通路)是机体极为重要的信号转导途径,主要由Akt和 Pi3k两个驱动部分构成。多种分子均可使Pi3k转变为有活性的p-Pi3k,活化的Pi3k经 串联级联反应活化Akt/Pi3k通路相应的信号分子Akt蛋白,最终激活相应信号通路,参 与调节细胞凋亡、增殖等过程[65]。Akt (别名蛋白激酶B,PKB),起到连接下游通路 纽带的作用,p-Pi3k可激活Akt使其发生磷酸化,调控下游信号蛋白:Bad、糖原合成 酶-3 (Glycogen Synthase Kinase-3,GSK-3)、哺乳动物雷帕霉素革巴蛋白(mammal Target Of Rapamycin, mTOR)、Bcl-2、核因子-kB (Nuclear Factor-kappa B,NF-kB), 参与多种细胞过程[23,24,66_68]。大量研究表明,缺血性脑疾病的发生发展过程中,该通路 被激活后对脑组织神经元起到正向积极的保护作用,Akt发生磷酸化活化,可促进Bd-2 的表达并降低Bax的水平,发挥保护作用[3(),67]。活化的Akt使下游靶蛋白GSK-3P磷酸 化,提高线粒体自樓水平,抑制Caspase-3的表达,调节细胞凋亡过程,减轻脑损伤程 度[6(),69]。另外,在缺氧缺血性脑病模型中发现,Akt/Pi3k信号通路可激活p-eNOS的 表达,减轻脑缺血/再灌注损伤[7G]。

总之,RIPC是一项具有广阔前景的诊疗策略,对缺血性脑损伤有着积极的保护作 用,不仅能保护缺血性组织损伤,X寸机体其他损伤也具有保护作用。虽然RIPC是相对 安全、有效、便捷的,但RIPC最佳处理方式、周期、次数、强度以及具体保护机制未 有定论,仍需大量研宄解决上述问题。
结 论
1.RIPC能使HIE大鼠脑组织内的CaSR异常表达受到抑制、激活Akt/Pi3k通路并上调 p-Akt的表达,保护受损脑组织;
2.RIPC通过促进Bd-2家族成员Bd-2表达同时降低Bax表达,参与保护受损神经元细 胞,起到脑保护作用;
3.5 min周期的重复RIPC可对HIE产生明显保护作用,且5 min周期与10 min周期的
RIPC对脑的保护作用无明显差异。