辽宁地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌分离株耐 药性研究及毒力基因检测

来源: 未知 作者:paper 发布时间: 2020-04-15 22:06
论文地区:中国 论文语言:中文 论文类型:医学论文
目录 摘要 1 1.1试验材料 13 1.1.1试剂及培养基 13 1.1.2试验所需药品 14 试验二奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌毒力基因检测与分析 28 2.1试验材料 28 2.1.1试验菌株 28 2.1.2试剂及培养基 28 试验三
目录
摘要 1
1.1试验材料 13
1.1.1试剂及培养基 13
1.1.2试验所需药品 14
试验二奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌毒力基因检测与分析 28
2.1试验材料 28
2.1.1试验菌株 28
2.1.2试剂及培养基 28
试验三 奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌毒力基因hla加表达水平与耐药相
关性分析 33
3.1试验材料 33
3.1.1试验所需菌株 33
3.1.2试剂及培养基 33
试验四 奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌耐药性对致病性影响 46
4.1试验材料 46
4.1.1试验菌株 46
4.1.2试验动物 46
结论 51
试验一 奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定与耐药性分析
奶牛乳房炎是奶牛养殖业上常见疾病,该疾病的发病率高,可造成奶牛产奶量下降, 乳汁品质降低等危害。引起奶牛乳房炎的因素有很多,主要由病原微生物引起感染,金 葡菌是导致奶牛乳房炎的重要病原菌之一。抗菌药物是治疗奶牛乳房炎的主要手段,如 卩-内酰胺类、大环内酯类等抗菌药物,然而由于抗菌药物的不合理使用,导致细菌耐药 性问题日益严重。因此,及时掌握某地区乳房炎主要致病菌及其耐药流行情况对于该地 区乳房炎的防治意义重大。
本研究从辽宁地区患临床型乳房炎奶牛的乳样中分离、生化鉴定金葡菌,并检测金 葡菌特有基因(m/c)进一步鉴定金葡菌分离株。采用微量肉汤稀释法测定不同抗菌药 物如卩-内酰胺类、大环内酯类和氨基糖昔类等抗菌药物对金葡菌的最小抑菌浓度,分析 其耐药表型。以期为有效防控辽宁地区乳房炎疾病提供科学指导。
1.1试验材料
1.1.1试剂及培养基
本试验使用的所有试剂详见于表1-1
1.1.4其他试验用品
移液器(2.5 jiL; IOjliL; 5-50(1L; 20-200(1L; 100-1000(1L)、移液器吸头(lmL、 200(1L、10(iL 禾 0 2.5(1L)、微孑 L 滤器(0.22(im)、烧杯(IL、500 mL、250 mL 禾口 100 mL)、量筒(lOOmL)、容量瓶(lOmL)、离心管(1.5mL、5 mL)、玻璃试管(10 mL)、锥形瓶(lOOmL、250 mL)、注射器(10mL、20 mL)、玻璃棒、玻璃培养皿、 一次性口罩、一次性手套、96孔细胞培养板等。
1.2试验方法
1.2.1乳样的采集
乳样采集于辽宁省沈阳市周边地区(新民、苏家屯、佟二堡)、抚顺地区不同规模 的8家奶牛场,选取患临床型乳房炎奶牛病例,无菌条件下采集乳样。
奶牛临床型乳房炎的诊断:肉眼可见患病奶牛的乳房呈现出不同程度的肿胀,具体 表现为乳房红、肿、热、痛等炎症反应,患病奶牛的乳汁呈灰白色、水样,触诊乳房有 大小不等的硬块,奶牛疼痛敏感,有的伴有体温升高、精神沉郁、食欲不佳甚至废绝等 症状。
采样时,先将奶牛按常规挤奶消毒后,将奶牛乳房及乳头用温水清洗干净后,使用 酒精棉球擦拭乳区进行消毒,由中心开始擦拭至整个乳区3次,取样者对其双手进行消 毒,消毒完毕后弃掉每个乳头头3把奶,开始采样,将乳样置于灭菌离心管中,并注明 采样日期、场次及编号,放入含冰袋的冰盒中,24 h内运送至实验室分离病原菌。
试验二奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌毒力基因检测与分析
金葡菌是导致奶牛乳房炎的主要病原菌之一,可引起奶牛乳房组织肿胀,乳腺泌乳 功能下降、乳汁内有乳块、絮状物等。金葡菌的致病性主要是由在特定环境条件下产生 的毒素、侵袭性酶和其他结构成分所导致的。所以许多国内外学者都在研究金葡菌各种 毒力基因。本试验利用PCR技术检测55株奶牛乳房炎金葡菌分离株毒力基因的分布情 况,从分子流行病学的角度对奶牛乳房炎源金葡菌毒力基因流行情况进行讨论,以期为 辽宁地区奶牛乳房炎疾病的监控、分子流行病学研究提供科学依据。
2.1试验材料
2.1.1试验菌株
55株金葡菌分离株;金葡菌质控菌ATCC29213由实验室保存。
2.1.2试剂及培养基
本试验使用的所有试剂详见于表1-1对应的所需试剂;本试验使用的培养基详见于 表1-2对应的所需培养基。
2.1.3试验仪器及设备
本试验所使用的仪器及设备详见表1-4
2.1.4其他试验用品
移液器(2.5 叫 10(1L; 5-50(1L; 20-200(1L; 100-1000(1L)、移液枪头(ImL; 200 pL、10pL 禾口 2.5 pL)、EP 管、离心管(1.5mL、5 mL)、冰盒、锥形瓶(100mL、 250 mL)、量筒(100mL)、玻璃棒等。
2.2试验方法
2.2.1培养基及溶液的制备
培养基及溶液制备同前述方法“124.1” 一致。
2.2.2金黄色葡萄球菌基因组DNA的制备
金葡菌基因组DNA模板的制备已经在试验一 “1.242”全部制备完毕。
试验三奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌毒力基因hla mRNA表达水
平与耐药相关性分析
金葡菌在产生耐药性的同时其本身也具有较强的致病力,金葡菌致病力强弱与其自 身产生的毒素与侵袭酶相关,而毒素及侵袭性酶主要由毒力基因编码,由此可见,毒力 基因的检测在研究细菌致病性时至关重要。近些年,有许多学者研究细菌毒力与耐药之 间关系的关系。所以本试验利用实时荧光定量PCR技术检测耐卩-内酰胺类药物种数不 同的金葡菌分离株毒力基因hla的mRNA表达量,由此探讨毒力基因hla与细菌耐药性 在转录水平上的关系,为深入研究奶牛乳房炎源金葡菌耐卩-内酰胺类药物对毒力的影响 奠定基础。
3.1试验材料
3.1.1试验所需菌株
9株金葡菌分离株均从辽宁地区患有临床型奶牛乳房炎的奶牛的乳样中分离鉴定得 到的,且均携带加q基因。
金葡菌标准株ATCC29213由本实验室保存。
试验四奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌耐药性对致病性影响
细菌获得耐药性对其自身毒力有一定的影响,近几年,许多国内外学者都在研究细 菌毒力与耐药之间的相关性。为确定辽宁地区奶牛乳房炎源金葡菌耐药表型对其毒力是 否具有影响,本试验选取9株耐卩-内酰胺类药物的金葡菌分离株,以金葡菌质控菌 ATCC29313为对照,采用腹腔注射致病菌的方式进行小鼠致病性试验,测定小鼠的感 染情况,检测不同耐药表型金葡菌致病性的强弱,分析辽宁地区奶牛乳房炎源金葡菌耐 药性与其毒力之间的关系,以期为有效防控辽宁地区乳房炎疾病提供科学指导。
4.1试验材料
4.1.1试验菌株
9株携带hla基因的金葡菌分离株,从患有奶牛乳房炎奶牛的乳样中分离得到的, 并将其保存,各菌株的耐药表型见于表3-8.
金葡菌质控菌ATCC29213由本课题组保存。
4.1.2试验动物
66只,18±22g的雄性昆明系小鼠(购买于辽宁长生生物技术有限公司)。在相 同环境下饲养小鼠,环境温度控制在24-26 °C范围内,2 d换一次垫料。
4.1.3主要试剂及培养基
本试验所使用试剂及培养基详见表4-1 o
4.1.4试验仪器及设备
本试验所使用的仪器及设备对应表1-4仪器及设备
4.1.5其他试验用品
眼科银子、手术剪、锥形瓶、玻璃平皿、一次性医疗注射器(lmL)、试管等用品。
4.2试验方法
4.2.1培养基的制备
培养基制备同前述方法“1.221” 一致。
4.2.2菌悬液的制备
(1) 从-80 £冰箱取出所需的金葡菌甘油菌,快速融解,使用移液器取甘油菌50 pL,接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基一侧,使用灭过菌的接种环划线培养,倒置于37 °C 电热恒温培养箱中培养24 h。挑取金葡菌典型单菌落于灭菌处理的NB培养基中,轻轻 摇匀,置于37 °C, 180 rpm摇床中振荡培养12 h。
(2) 取培养浑浊的菌液在甘露醇氯化钠琼脂培养基上划线培养,37 °C电热恒温 培养箱中培养24 h,若观察到培养基上有典型金葡菌单菌落生长,重复上一步骤,菌液 培养至ODgoo约为0.7。
(3) 步骤(2)所获得的菌液共50 mL,此菌液4000 rpm离心5 min,将上清液 全部弃掉;使用移液器加入3 niL生理盐水于离心管中,将菌体沉淀吹打混匀,以4000 Tpm离心2 min,弃去上清液,得到的菌体沉淀按上述步骤操作(重复3次)。向收集 到的菌体沉淀中加入3 mL生理盐水,使用移液器吹打混匀二十下左右,即得含菌量约 为lxlO9CFU/mL菌悬液。
结论
辽宁地区临床型奶牛乳房炎金葡菌分离株对青霉素和林可霉素耐药率最高,对头抱 卩奎诺、土霉素和红霉素等耐药率较高,而对杆菌肽和氨基糖昔类药物最为敏感。
辽宁地区奶牛乳房炎金葡菌毒力基因hla, elfA,加弘携带率为58.18%、36.36%、 29.09%,未检岀毒力基因$加、seb> eta、etbo
辽宁地区奶牛乳房炎金葡菌毒力基因加Q的mRNA表达量随着耐卩-内酰胺类药物种 数的增多呈现下降趋势。
辽宁地区奶牛乳房炎金葡菌随着耐卩-内酰胺类药物种数的增多,其致病性呈现下降 趋势。