慕于右旋糖肝蔗糖酶对咖啡酸苯乙酯 的糖基化及其糖莒产物的活性研究

来源: 未知 作者:paper 发布时间: 2020-04-09 11:22
论文地区:中国 论文语言:中文 论文类型:医学论文
生物糖基化是改善天然化合物用于治疗药物开发的生物活性和物理化学性 质的有效策略。在该研究中,两种咖啡酸苯乙酯(CAPE)葡糖昔(G-CAPE和 2G-CAPE)通过用来自肠膜明串珠菌(Le
生物糖基化是改善天然化合物用于治疗药物开发的生物活性和物理化学性 质的有效策略。在该研究中,两种咖啡酸苯乙酯(CAPE)葡糖昔(G-CAPE和 2G-CAPE)通过用来自肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) 0326的葡聚 糖蔗糖酶以CAPE作为受体和蔗糖作为供体进行转糖基作用来合成。通过柱层 析法纯化产物并利用1DNMR、2DNMR手段表征解析化合物的结构。
评估两种CAPE葡糖莒的物理化学性质以及抗炎活性、细胞毒性、抗氧化活 性、抗肿瘤活性等生物活性。G-CAPE和2G-CAPE的水溶性有明显改善,分别 是CAPE的35和90倍。糖基化显著降低了 CAPE的细胞毒性。与CAPE相比, 单糖莒产品具有优异的抗炎作用,在20 0 下对RAW 264.7巨噬细胞的NO, IF・6和TNF-a抑制率分别为93.4%, 76.81%和56.58%。些糖基化修饰的CAPE 避免了抗炎药物中CAPE应用中的一些缺陷。
对具有优异活性的G-CAPE进行抗炎机制的探究oG-CAPE通过作用细胞膜 上的TLR4,阻断受体下游信号通路NF-kB的激活,阻断炎症信号的传导,抑 制COX-2和iNOS炎症介质的表达,从而抑制各种炎症因子的分泌,而展现出 抗炎的作用效果。分子模拟表明,G-CAPE的糖基部分会和MD2的Arg90、Glu92、 Cysl33的残基形成氢键作用,这使G-CAPE与MD2的结合亲和力增强,从而抗 炎活性增强。
优化CAPE酶法糖基化反应,为得到更多的G-CAPE,该酶促反应最优的反 应温度是30°C,最适合的pH是50最优的蔗糖浓度是750mMo
本研究通过右旋糖酹蔗糖酶对CAPE糖基化,改善了抗炎药物CAPE应用 中的一些缺陷,产物G-CAPE的抗炎活性显著提高。进一步研究了 G-CAPE的 抗炎机制,对抗炎药物的研发有重要意义。
第一章馳 1
L1右旋糖昔蔗糖酶的概述  1
1丄1右旋糖酹蔗糖酶简介 1
I.1.2右旋糖酹蔗糖酶的结构 1
II.3右旋糖酹蔗糖酶的催化机制   2
1.1.4右旋糖酹蔗糖酶的糖基化作用 4
第二章咖啡酸苯乙酯酶法糖基化反应 10
2.1引言 10
2.2实验室用品 10
221试剂 10
2.2.2仪器设备 11
第三章咖啡酸苯乙酯粉的分离纯化及结构瞬 20
3.1引言 20
第四章 咖啡酸苯乙酯糖昔的水溶性及生物活性评价 29
4.1引言 29
4.2试剂与仪器 29
4.2.1细胞 29
4.2.2实验试剂 29
4.2.3 仪器 31
第五章G-CAPE抗炎活性机制的探究   46
5.1引言 46
5.2实验材料与设备 47
第六章咖啡酸苯乙酯酶法糖基化工艺优化 57
6.1实验室用品 57
6.1.1试剂 57
第七章总结与展望     70
7.1总结 81
第一章绪论
1.1右旋糖昔蔗糖酶的概述
1.1.1右旋糖酹蔗糖酶简介
右旋糖肝蔗糖酶(Dextransucrase, EC2.4.1.5),又称葡聚糖蔗糖酶(GS), 是一种细胞胞外葡萄糖基转移酶(GTF),它催化D・毗喃葡萄糖基残基从蔗糖转 移到葡聚糖,而果糖则被释放。右旋糖軒蔗糖酶是高分子量的细胞胞外酶,大小 通常在120-200kDa范围目前为止,所有鉴定的GS除少数假设的GS基因外都 属于乳杆菌属的范围,限于乳杆菌属(Lactobacillus')^,明串珠菌属(Leuconostoc mesenteroides}⑴,链球菌属(S血ptococcus)和魏斯氏菌属(WdsseHa)⑷。根 据CAZy分类系统⑴,基于氨基酸序列相似性,GS被分类为糖昔水解酶家族70 (GH70)酶。在GH家族中,催化机制和催化残基是保守的⑹。GS (GH70)在 机理上,结构上和进化上与GH13和GH77家族酶密切相关,并且它们一起形成糖 昔水解酶的GH-H家族叫Gk・H家族酶的共同特征是,它们使用八个重复的(a/05 桶装催化结构域,来切割葡萄糖部分与另一部分(葡萄糖,果糖等)部分之间的 糖苜键,来合成葡聚糖[刃。对于每种类型的GH・H酶,催化结构域用N■和/或C・末 端结构域修饰,其他结构域的类型和数量是不同的,这表明其他结构域决定了 GH”H酶的反应特异性[[叭虽然,反应特异性很大程度上取决于催化结构域。但 是,许多其他结构域,对于酶的催化活性是必需的〔⑴。此外,它们通常是碳水化 合物结合模块,为酶提供碳水化合物结合功能。
1.1.2右旋糖SF蔗糖酶的结构
右旋糖苜蔗糖酶包含五个结构域A、B、C、IV和V,其中A、B、IV和V 结构域由多肽链连接的,两个不连续区段构建而成的,使得蛋白整个呈U形,从 N-末端到C-末端,多肽链依次链接结构域V、IV、B、A、C、A、B、IV和V。 只有C结构域由一个连续多肽组成[12]o
结构域A,包括由8组相互交错的a折叠、卩螺旋构成的(o/卩)8桶状保 守催化区域,在该催化中心包含了四个同源保守序列I、II、III和IV,催化反 应在其中三个关键氨基酸酸位点(亲核试剂的天冬氨酸、酸/碱的谷氨酸和稳定 过渡态的天冬氨酸)上进行,三个关键催化残基位于该区域的口袋底部[13]。同 源保守序列IL III和IV在结构域A的N・末端,第四个同源保守序列I位于结 构域A的O末端部分[14]o
” 结构域B由5、6个高度扭曲的反平行卜折叠组成,该结构域位于催化结构 域A旁边,对GS功能也很重要[15]。首先,该区域中的一些loop有助于使催化 位点附近的凹槽成形。其次,结构域B与结构域A的界面处的残基在距离亲核 天冬氨酸约10个残基处形成钙结合位点[16]o研究已经证明Ca2+的存在对于 GTFA-N[ 17]和GTF180-N[l8]的活性是必需的。
结构域C也位于催化结构域A的旁边,由8个0-折叠组成,在所有GS结 构以及大多数GH13酶中都是保守的[1刃,但作用机制尚不明确。
结构域IV的结构揭示了新的»折叠,与任何其他已知的蛋白质结构没有相 似性。结构域IV和V之间的连接由两个相对较长的多肽段组成,没有二级结构, 并且不同GS结构中结构域V相对于蛋白质其余部分的相对位置表明这些区段 具有一定的灵活性[20] o
位于域IV旁边的域V,由N-和C末端片段(GTF180-N, GTFA-N)或仅N 端片段构建(DSR-EGBD-CD2)。GS的N-和C-末端区段的长度和序列变化很 大,它们被指定为“葡聚糖结合结构域”(GBD) [21],并且已经在许多研究中研 究了它们的重要性,包括截短和缺失突变体[22]o
1.13右旋糖肝蔗糖酶的催化机制
GS的反应机理是双置换机制㈡],首先在底物一 1 (葡萄糖)和+1 (果糖) 之间切割底物的糖昔键,与关键氨基酸残基天冬氨酸形成共价的葡糖基-酶中间 体,随后葡萄糖基部分被转移到具有保留的吐异构构型的受体上(图1.1) O根 据受体的不同,反应可分为三种类型,水解反应、聚合反应和受体反应(图1.2)。 葡萄糖基部分是否连接到受体的非还原端或还原端是一个有争议的问题,这些机 制将分别需要一个或两个活性位点来进行完整的反应循环。研究表明在GTF180- ND1025N突变体中,催化残基D1025, E1063和D1136与底物蔗糖的相互作用 完全支持这种机制0】。其葡糖基2 -OH和3 -OH基团与过渡态稳定残基(D1136, GTF180-N编号)通过氢键结合GS [25],质子化的一般酸/碱(E1063)将其质子 贡献给糖背氧,同时底物的异头C1碳原子被亲核残基(D1025)的一个竣基氧 攻击,导致通过以氧代拨基离子的形式形成共价■葡糖基酶的过渡中间态,如图 1.1所示。GTF180-N通过与三种保守残基的相互作用来稳定部分平面过渡态, 这些残基分别是过渡态稳定剂(D1136),精氨酸(R1023)和谷氨酰胺(Q1509) [26]


1・1・4右旋糖軒蔗糖酶的糖基化作用
酶通常具有高度的选择特异性和产物特异性,因此是化合物合成中有价值的 催化剂[勿。在含糖分子的化学-酶促合成中,酶可以沁格控制区域和立体特异性
[28]o糖基化是通过使用糖基转移酶的UDP / ADP-葡萄糖或通过使用廉价底物如 蔗糖或淀粉作为葡萄糖基的供体的糖昔水解酶将葡萄糖基转移到其他底物上的 过程(28]oGSs在所谓的受体反应中有效地将葡萄糖部分从蔗糖转移到许多含径基 的分子中[29],如对苯二酚、儿茶素、榊皮素、没食子酸酯等。GSs在更天然类物 质的葡糖基化中也是有效的,例如短寡糖㈤1,当蔗糖与麦芽糖比例为2:1时肠系 膜芽砲杆菌NRRLB-512FGS合成DP3至DP9的异麦芽低聚糖⑶)。当肠系膜芽 抱杆菌NRRLB-512FMCM的葡聚糖蔗糖酶与非常高浓度的蔗糖一起温育时,会 发生另一种受体反应,在这些条件下,会生成异麦芽糖和蔗糖异构体帕拉金糖和 亮氨酸①】。蔗糖异构化也在较低的蔗糖浓度下发生,但在高蔗糖浓度下,蔗糖异 构体可进一步有效延长,以获得DPs高达11的产物混合物【列。不同的GS,受 体反应特异性差别很大〔珂。因此,除了优化反应条件外,还应选择最适合应用的 GS。使用“蔗糖”样分子将GSs用于转移非葡萄糖部分,其中葡萄糖用半乳糖、 阿洛糖、木糖等代替作为供!本底物,这些化合物已由蔗糖和单糖酶促合成【匹切。
1.2天然产物糖昔衍生物
1.2.1天然产物糖昔衍生物与新药研发
天然产物广泛存在于自然界中,其数量种类繁多且结构复杂多样,许多天然 产物活性成分现在已经作为治疗各类疾病的药物,还有一些作为潜在的药物,具 有抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射和免疫调节等诸多活性,已成为 国内外天然药物开发利用研究的热点阿。天然产物中有许多具有药理生物活性的 化合物,在发现基于化学的药物制剂之前,大多数药物治疗方案都是基于天然的 有效活性植物㉚。然而并非所有生物活性天然产品都适合临床使用,由于溶解性、 生物利用度、毒性或对抗性生物无效的问题,使得它们的类似物的制备在药物发 现工作中是重要的。目前药物开发的主要途径之一,就是从天然产物中寻找有良 好药理活性的先导化合物3,在此基础上对其结构进行化学改造,来解决其实际 治疗应用中的限制,如水溶性、脂溶性、稳定性等,改善其理化性质、作用选择 性、药理活性及安全性,为增大其成药的可能性。由于它们的结构复杂性,许多 天然产物难以通过纯合成方法制备或改性。由于在全合成中经常遇到的困难,现 有生物合成机器的重新设计提供了用于产生天然产物糖昔衍生物的替代方法,其 具有几个明显的优点:获得通过合成方法不易获得的化学衍生物结构,易于化合 物生产,减少有毒副产物的产生,该方法的可扩展性以及进行组合生物合成的潜 力。
1.2.2天然产物酶法糖基化
候选药物与碳水化合物作为天然保护基团的偶联可显着提高其稳定性、水溶 性,最重要的是可以提高它们的生物利用度[小。然而,化学糖基化方法需要多个 反应步骤,包括广泛的保护基团化学。这导致低原子经济性和通常低产率,使得 一步酶促葡糖基化成为有潜力的替代方案。生物酶修饰相对于化学和物理方法, 具有独特的优点,特异性高,制备简单,环境友好⑷]。
受体反应中,葡聚糖蔗糖酶可对其它含疑基的分子葡糖基化,形成的糖昔通 常具有改善的物理化学性质(如水溶性和稳定性)和生物学性质,提升一些难溶 于水的药效分子的成药可能性。该反应可以适应很多受体分子的修饰,这对于药 效分子的改性是一个十分有效的途径,相较于传统的化学改性®】、固体分散/纳 米颗粒技术昭'、制备环糊精的复合物方法【的更加经济环保,反应也更加简单、便 捷,目前通过右旋糖昔蔗糖酶对药效分子的糖基化修饰也成为了一个砺究热点。
123天然产物糖基化的应用
许多研究都集中在葡萄糖基转移酶介导的酚类化合物的糖基化上,其具有令 人难以置信的各种糖部分,以改善分子的物理化学和生物学性质,增强其生物利 用度,改善其生物学性质或改善抗自氧化分子的稳定性妙4化 利用L. mesenteroides B-512FMCM进行转葡糖基糖化来改善咖啡酸的水溶性,抗脂质过 氧化作用和抗褐变性阿卡波糖糖昔衍生物显示出对a■葡萄糖昔酶(一种与 糖尿病有关的酶)的有效抑制作用。通过肠膜明串珠菌B-512FMC进行糖基化反 应。使用肠系膜芽砲杆菌B-512FMC合成了糖基化的表没食子儿茶素没食子酸 酯,这些葡萄糖昔在紫外线辐射下的稳定性和在液体水中的溶解度均有提高〔呦。 使用肠系膜酵母合成对苯二酚葡萄糖昔由于其具有优异的清除活性,已被认为是 一种潜在的皮肤美白剂[锢。此外,糖基部分可能影响其药代动力学,在分子水平 上引起生物特异性,甚至可以确定精确的作用机制⑷1。
1.3咖啡酸苯乙酯
蜂胶是一种来自蜜蜂的天然产品,由于它的一些世纪以来在民间医学中很 受欢迎[50]o对脓肿、溃疡疮和伤口愈合有益。咖啡酸苯乙酯(CAPE)是蜂胶 中最有前途的活性成分之一。它具有多种有益的生物学特性,包括抗菌、抗氧 化、抗病毒、抗炎和抗癌作用[51]。
1.3.1咖啡酸苯乙酯的抗炎活性评价
Toll样受体(TLRs)作为模式识别受体之一,通过感知微生物病原体上的保 守分子模式和增强免疫反应,在宿主防御中发挥关键作用炉]。TLR是I型跨膜 受体,具有包含富含亮氨酸的重复基序的胞外域,跨膜结构域和胞质Toll /白细 胞介素-1受体同源结构域W TLR4是第一个表征TLR并通过识别脂多糖(LPS) (革兰氏阴性细菌的细胞壁成分)来负责革兰氏阴性细菌诱导的败血症[列。
TLR4对LPS的识别需要MD2,因为LPS的大多数脂质链与MD2中的疏水口 袋相互作用[旳。MD2是一种糖蛋白,当在细胞表面表达时,与TLR4形成复合 物〔河。LPS与TLR4 / MD2复合物的结合引发两个TLR4 / MD2复合物的二聚| 化鬥 其导致两个主要衔接分子的募集,MyD88[56]和TRIFID,并激活细胞内信 号通路,产生促炎细胞因子oMyD88是大多数TLR常见的衔接分子,它介导TNF 受体相关因子IL-6和IKKb复合物的激活[冈,由于IkB蛋白的磷酸化和降解以 及丝裂原活化蛋白激酶的激活,导致转录因子NFkB和AP-1的激活〔旳。TRIF 通过TANK结合激酶1 (TBK1)和IKKe引起干扰素调节因子3 (IRF3)的磷酸 化和活化以及随后的I型干扰素(IFN)和IFN诱导型基因的表达[叫 TRIF还 通过受体相互作用蛋白1 (RIP1)在晚期激活NF・kB信号通路⑹]。
研究发现,CAPE可减轻脂多糖(LPS)诱导的皮肤炎症中的炎症症状动物 模型并持续降低LPS刺激的巨噬细胞中各种炎性细胞因子和趋化因子的表达, 从而保护细胞免受损伤和潜在死亡[62]oCAPE可以抑制LPS诱导的核因子(NF) ・kB和干扰素调节因子的活化3 (IRF-3),炎症反应中的关键转录因子,它控制 几种细胞因子的产生,如肿瘤坏死因子w (TNF-a)或白细胞介素-6 (IL-6)[叫 另夕卜,最近的研究已经证明CAPE阻断LPS与TLR4/MD2复合物的结合,通过 在MD2的疏水口袋中与Cysl33形成加合物而阻止LPS与TLR4 / MD2复合物 的结合,从而损害下游信号激活【冋。CAPE是抗炎治疗的有希望的候选药物,但 其口服摄入后的低生物利用度是其作为临床治疗的潜在用途的限制。尽管CAPE 是众所周知的抗炎剂,但由于其低溶解度和细胞毒性,其使用受到一些限制。
1.3.2咖啡酸苯乙酯的抗肿瘤活性评价
CAPE是蜂胶中的一种有效的抗癌成分[64'66]o CAPE拥有众多重要的生物 活性,包括抗菌、抗病毒「抗氧化、抗炎和抗癌[67-701o CAPE是一种众所周知且 记录良好的转录因子核因子kB(NF-jB)抑制剂EG]以及细胞凋亡诱导剂。CAPE 介导的细胞凋亡伴随着人白血病HL-60细胞中caspase-3的激活,Bcl-2的下调 和Bax的上调【7铁CAPE通过其凋亡作用,调节NF-jB信号的活化、细胞周期和 血管的生成,抑制MDA-231和MCF-7人乳腺癌生长⑺】。在低剂量时,CAPE杀 死多种类型的癌细胞,而对正常细胞无毒性。有几项研究报道了 CAPE在多种 癌症模型中的体外和体内抑制作用,如结肠癌、肺癌、黑色素胶质瘤、胰腺癌、 胃癌、胆管癌、肝细胞癌r76-80]o CAPE作为血管生成,肿瘤转移和侵袭的抑制剂 的作用已经在血管生成模型,体外和体内结肠癌细胞几个方面得到证实⑻]。
13.3嗽啡酸苯乙酯的抗氧化活性评价
,细胞通过利用氧气作为氧化磷酸化的能量来源。在该过程中,ATP前生成伴 随着四个质子添加到o2以形成两个H2O分子的反应。但是当02分子只和一个 质子结合时,会生成超基(OH-)和过氧亚硝酸盐(0N00・)。尽管控制ROS的 产生具有重要的生理作用,但是ROS的高产量不能被细胞抗氧化防御产生氧化 应激平衡。已提出氧化应激在许多疾病的发病机制中发挥重要作用,包括癌症、 心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、缺血/再灌注(I/R)损伤、糖尿病、神经 退行性疾病邙可尔茨海默病和帕金森病)、类风湿性关节炎和衰老因此,抗 氧化剂可在各种疾病状况中起重要的保护作用。
CAPE在许多研究中显示出抗氧化活性,可以抑制ROS的产生⑻】。近期研 究表明,CAPE保护肾脏免受伤害衰老相关的氧化损伤大鼠。其潜在机制归因于 减少丙二醛(MDA)水平并同时升高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、 谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性和老年大鼠肾组织中还原型谷胱甘肽(GSH) 水平。此外,Yilmaz等人【旳表明CAPE可以防范脂质过氧化和补充肝脏组织中 抗氧化酶的活性链腺佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型。STZ用于糖尿病的 实验诱导,并且已知在多个靶组织中产生氧化应激。
1.3.4 啡酸苯乙酯对神经性疾病的治疗作用
咖啡酸苯乙酯是治疗神经退行性疾病的有希望的化合物基于其报道的抗炎 活性,可以预期神经保护作用[8S87]O慢性炎症通过炎性诱导的黑质纹状体多巴胺 能神经元的神经变性在PD的进行性中发挥关键作用。咖啡酸苯乙酯可以通过抑 制促炎介质iNOS和COX-2的表达来抑制炎症因子TNF-a和IL-ip的分泌,从 而起到神经保护的作用。咖啡酸可以抵抗这些神经性疾病的组织病理学异常,并 导致存活神经元数量增加。同样,据报道,咖啡酸苯乙酯可在动物模型中提供神 经保护,如神经元损伤,如戊四卩坐诱导的癫痫发作[叫5$半胱氨酰■多巴胺诱导 的神经毒性【8刃,6-OHDA神经元丢失〔9°〕和MPTP神经变性["I。
1.3.5咖啡酸苯乙酯的应用限制
CAPE是蜂胶中的有效活性成分,在不同产地的蜂胶中含量差异较大,CAPE 在来自中国的蜂胶中的含量最高,可达达到15-29mg g1但是来自巴西的蜂胶中 基本上没有CAPE成分[92]O然而,CAPE在抗肿瘤、抗氧化阿%】、抗炎[瞪9叭 免疫调节3]等生物活性中显示出重要作用,随着对CAPE生物活性的深入研究, 关于CAPE相关新药的研究和开发急需发展。
然而,原料的规模制备是其工业化的基本瓶颈。所以大规模制备CAPE —直 是热点和难点。此外,由于CAPE的低溶解性和细胞毒性,但其口服摄入后的低 生物利用度是其作为临床治疗的潜在用途的限制。解决CAPE在实际治疗中的 限制,显得尤为关键。
1.4课题研究意义及内容
CAPE是蜂胶中的一种主要的天然活性成分,许多研究表明,CAPE在多种 系统中具有抗菌,抗炎,抗氧化,抗病毒,抗癌和免疫调节等多功能的生物学特 性。在传统医学中CAPE常作为蜂胶成分口服给药,因其较差的水溶性和稳定 性,限制了其的生物利用度,因此在不影响其生物活性基础上的物理改性对其成 药显得尤为必要。
本研究是在实验室通过原始工程菌突变改造得到的一株高活性、热稳定性显 著提高(保留所有功能且不改变右旋糖酹产物特性)的工程菌dexYG P473S/P856S基础上,利用该工程菌表达的右旋糖酹蔗糖酶的糖基化能力对咖啡 酸苯乙酯进行糖基化结构修饰改造,合成新的咖啡酸苯乙酯糖昔,对其物化性质 及生物活性,如抗氧化性、抗炎活性、抗癌活性等进行评估,改善咖啡酸苯乙酯 在实际治疗中的各种限制如水溶性、稳定性、细胞毒性等等,以期能提高它的生 物活性,提高其成药潜能。具体研究内容如下:
1)构建咖啡酸苯乙酯的HPLC、TLC检测方法;

2) 利用右旋糖酹蔗糖酶的转糖基作用,对咖啡酸苯乙酯进行糖基化,利用HPLC. TLC手段确定糖昔产物;
3) 分离纯化CAPE糖昔产物后,借助一维、二维核磁手段表征解析糖昔产物结 构;
4) 优化CAPE糖昔的酶法合成工艺;
5) 评价CAPE糖苜产物的物理化学性质,与CAPE进行比较;
6) 评价CAPE糖昔产物的细胞毒性及生物活性,抗炎、抗氧化、抗癌;
7) 针对有显著改善的生物活性做机制探究,利用实验及生物信息学软件分析模 拟,分析活性提高原因。
第二章咖啡酸苯乙酯酶法糖基化反应
2.1引言
炎症是一种对病原体入侵和组织损伤做出反应的非特异性的免疫过程,这是 一个多方面的复杂的过程,受这些种刺激激活的免疫细胞和炎症细胞被吸引到损 伤部位,并在刺激下细胞释放多种炎症介质,从而吸引更多细胞进入炎症部位〔呵。 炎症过程已被证明为是有目的、有力的和自我限制的,是促炎和抗炎信号之间的 平衡。许多人类疾病,组织的破坏和器官的功能丧失都涉及到了持续存在炎症反 应。慢性炎症是一个严重的医学问题,因为它参与关节炎、癌症、心血管疾病、 自身免疫性疾病和神经系统疾病的发病机制。许多研究表明消除慢性炎症的问题 是预防各种慢性病的关键途径【闵。
有许多天然化合物已经被证明可以通过不同的机制靶向和干扰慢性炎症反 应,在许多病理过程中对机体提供保护。蜂胶是一种来自蜜蜂的天然产品,由于 它对脓肿,溃疡疮和伤口愈合的一些有益作用,在民间医学中很受欢迎。咖啡酸 索乙酯是蜂胶中最有前途的活性成分之一,它具有多种有益的生物学特性,包括 抗菌,抗氧化,抗病毒,抗炎和抗癌作用。CAPE是抗炎治疗的有希望的候选药 物,但其口服摄入后的低生物利用度限制了它作为临床治疗的潜在用途,尽管 CAPE是众所周知的抗炎剂,但由于其低溶解度和细胞毒性,它的使用受到一些 限制叫
为了解决这些问题,我们利用右旋糖軒蔗糖酶来对CAPE的进行生物糖基 化,以期改善其生物活性和物理化学性质。
第三章 咖啡酸苯乙酯糖昔的分离纯化及结构解析
3.1引言
在之前研究中,我们已经确认了咖啡酸苯乙酯是右旋糖酹糖昔蔗糖酶的新受 体底物,右旋糖昔蔗糖酶以蔗糖为糖基供体对CAPE进行糖基化,生成新的CAPE 糖昔。通过液质联用检测,我们确认了 CAPE的糖苜产物主要为单糖昔和二糖甘 两种。
在本章的研究中,我们将尝试对两种糖昔产物进行分离纯化,得到高纯度的 两种化合物后,以期对两种化合物的结果进行解析确认。
第四章咖啡酸苯乙酯糖昔的水溶性及生物活性评价
4.1引言
咖啡酸苯乙酯因其具有的广泛有益的生物学特性,包括抗菌,抗氧化,抗 病毒,抗炎和抗癌作用,而成为医学领域研究的热点生物活性成分[闻。我们通过 右糖昔蔗糖酶对CAPE进行糖基化,成功分离纯化得到了两种CAPE的糖昔纯 品并解析了两种新型化合物的结构如图3.8, 3.9。糖基化通常会改变化合物的理 化性质,如提高水溶性及稳定性,甚至会影响化合物的生物活性。
在本章的研究中我们将探究就CAPE与其糖昔产物在物理化学、生物活性 上的差异性,探究糖基化对CAPE化合物的理化性质及生物活性的影响。
第五章G-CAPE抗炎活性机制的探究
5.1引言
炎症是一个包括外部刺激激活免疫系统的生理和病理的复杂过程〔刃。如果 炎症反应的调节被破坏,则可能发生各种炎性疾病,例如关节炎,炎性肠病和哮 喘。巨噬细胞活化和炎症介质的释放对于许多疾病的进展是必需的。炎症介质, 包括一氧化氮(NO),环氧合酶・2 (COX-2),前列腺素E2 (PGE2)和核因子 kB (NF-kB)是免疫反应的关键调节因子,因此是新治疗策略的潜在靶标[初。
Toll样受体(TLRs)作为模式识别受体之一,通过感知微生物病原体上的保 守分子模式和增强免疫反应,在宿主防御中发挥关键作用。Toll样受体4CTLR4) 是先天免疫的必需调节剂,并且与先天免疫和代谢紊乱有关。革兰氏阴性细菌产 物脂多糖(LPS)是一种触发TLR4激活并激活多种炎症信号的病原体。对于LPS 反应,TLR4激活需要首先与髓样分化蛋白2 (MD2)的辅助蛋白在细胞膜上形 成复合物,之后MD*/TLR4复合物可识别LPS并与之结合,导致TLR4被激活。 MD2是LPS识别必不可少的细胞外分子[58]oLPS与MD2/TLR4的结合导致两种 主要衔接蛋白MyD88. TRIF的募集,并激活细胞内信号通路,产生促炎细胞因 子。
TLR介导的免疫反应的失调可导致各种炎性疾病,包括动脉粥样硬化,类风 湿性关节炎,糖尿病和癌症[说&叽因此,TLR活化的药理学调节可能对免疫相关 疾病有益。研究证明CAPE通过在MD2的疏水口袋中与氨基酸残基形成加合物 而阻止LPS与TLR4/MD2复合物的结合,从而损害下游信号激活,LPS和TLR4 /MD2复合物之间的相互作用是抗炎剂CAPE的新靶点[呦。
我们通过对酶法对CAPE的糖基化,得到抗炎活性改善的G-CAPEoG-CAPE 比CAPE和2G-CAPE发挥更强的抗炎作用。此外,G-CAPE具有较低的细胞毒 性和较高的水溶性。由于CAPE的多种生物活性,一直备受关注,而它的单糖昔 G-CAPE显示出很大的炎症性疾病治疗的潜力,进一步的研究可以为开发预防慢 性炎症性疾病的新药提供有益的信息。在本章研究中,我们将探究G-CAPE的抗 炎机制,以期找到它的抗炎靶点及活性改善的原因。
第六章 咖啡酸苯乙酯酶法糖基化工艺优化
6.1实验室用品
6.1.1试剂
6.1.3培养基
LB液体培养基:LB培养基的使用非常广泛,是普遍用来培养大肠工程菌 杆菌的基础培养基⑴。配制1LLB液体培养基:称取酵母浸粉5.0g,胰化蛋白腺 10 g,氯化钠10 g,加入适量去离子水,待加热完全溶解后定容至1L,用浓度为 0.5 moL/L NaOH溶液调节pH至7.0,每50 mL培养基分装于250 mL锥形瓶 中。分装好后,在121 °C下,高压蒸汽灭菌20 min。
配制LB固体培养基:向1LLB液体培养基中,添加10g (l%w/v)的琼脂 粉,用0.5 moL/LNaOH溶液调节pH至7.0,在121 °C下,高压蒸汽灭菌20 min。 灭菌后,待培养基稍稍冷却,以瓶底不烫手为标准,将融合化的LB固体培养基 倒入培养皿中,每个培养皿约添加20-25 mL,并添加0.1% (v/v) 0.1 mg/mL卡 那霉素抗生素溶液,充分晃匀后盖上盖片,在无菌操作台中冷却凝固,紫外灯照 射 30mino
配制发酵培养基:发酵培养基的组分及各组分配制浓度为:蛋白陈1 g/100mL、 硝酸钾 lg/100mL、葡萄糖溶液 25% (w/v)、甘油 50% (w/v)、MgSO4*7H2O 2.46g/100 mL. M9 盐溶液(Na2HPO412H2O 17.1 g/lOOmL. KH2PO4 3 g/lOOmL 和NH4C13g/100mL) o将蛋白豚和KNCh —起配制,溶解后分装于500mL的三 角瓶中,172mL/瓶分装。将上述溶液在121 °C、0.1 MPa条件下蒸汽灭菌20 min。 使用该培养基发酵细菌前,添加配制好的并灭菌后的葡萄糖溶液4mL、甘油溶液 2mL、MgSO4 溶液 200 pL、M9 盐溶液 20 mL。因 Na2HPO412H2O 含有结晶水, 为避免定容时溶液体积过量,配制M9溶液时应添加少量的水溶解后,再用容量 瓶定容。
6.1.4配制相关试剂
6.1.4.1配制0.1 g/mL卡那霉素溶液
1.将多个注射器配套的规格为0.22 gm微孔滤膜头置于100 mL小烧杯中, 密封包扎;将数个1.5 mL离心管,一个注射器,装入100 mL烧杯中,密封包 扎;将100 mL的纯化水装入250 mL锥形瓶中,密封包扎锥形瓶及一个50 mL 小烧杯,将上述物品在121 °C下高压蒸汽灭菌20 mino
2.将电子天平和灭菌好的各物品放入无菌操作台中,打开紫外灯持续照射 30 min,使操作环境无菌。
3.吸取10 mL纯化加入50 mL小烧杯中,再用电子天平准确称取1 g的卡 那霉素粉末加入水中,搅拌溶解至完全澄清,用注射器吸取卡那霉素溶液,经
0.22ym微孔滤膜过滤后,加入1.5 mL离心管中,做好标记后,放于-20 °C冰箱 中长期保存。
6.1.4.2 配制 0.025g/mL IPTG 溶液
1.将多个注射器配套的规格为0.22 pm微孔滤膜头置于100 mL小烧杯中, 密封包扎;将数个1.5 mL离心管,一个注射器,装入100 mL烧杯中,密封包 扎;将100 mL的纯化水装入250 mL锥形瓶中,密封包扎锥形瓶及一个50 mL 小烧杯,将上述物品在121 °C下高压蒸汽灭菌20 mino
2.将电子天平和灭菌好的各物品放入无菌操作台中,打开紫外灯持续照射 30 min,使操作环境无菌。
3.吸取40 mL纯化加入50 mL小烧杯中,再用电子天平准确称取1 g的 IPTG粉末加入水中,搅拌溶解至完全澄清,用注射器吸取卡那霉素溶液,经0.22
微孔滤膜过滤后,加入1.5 mL离心管中,做好标记后,放于・20°C冰箱中长 期保存。
6.143乙酸一乙酸钙缓冲液(pH=5.4)的配制
1 •称取8.8 g乙酸钙固体于烧杯中,再加入1000mL蒸憾水,充分搅拌,使 其溶解均匀,即得到浓度为0.05 moL/L的乙酸钙溶液。
2.将100 mL蒸憾水加入烧杯中,在水中加入29.5 pL的冰乙酸,得到浓度 为0.05 moL/L乙酸溶液。
3.将冰乙酸溶液逐渐加入乙酸钙溶液中,边搅拌均匀,边用pH计监测pH, 直至pH达54。配置好后将缓冲液放置于4 °C冰箱保存。
第七章总结与展望
7.1总结
在本研究中,我们通过来自肠膜明串珠菌(Leuconostocmesentefoides) 0326 的葡聚糖蔗糖酶的工程菌dexYG P473S/P856S诱导产生右旋糖昔蔗糖酶,利用 右旋糖昔蔗糖酶对咖啡酸苯乙酯酶法糖基化,得到了两种咖啡酸苯乙酯葡糖背 (G-CAPE和2G-CAPE)。通过柱层析和TLC法对两种糖苛产物分离纯化。借 助1DNMR、2DNMR手段表征解析化合物的结构,G-CAPE的结构为a-D-Glcp- (1 J4)-CAPE, 2G-CAPE 结构为 a-D-Glcp-(r^3*)- a-D-Glcp-(l'^4)-CAPEo
评估了 CAPE糖昔产物的物理化学性质以及抗炎活性、细胞毒性、抗氧化活 性、抗肿瘤活性等生物活性。G-CAPE和2G-CAPE的水溶性有明显改善,分别 是CAPE的35和90倍。糖基化显著降低了 CAPE的细胞毒性,使安全给药剂 量从5 yM提升到80gMo糖基化基本不影响CAPE的抗氧化活性,而CAPE的 抗肿瘤活性随着化学结构中糖基的引入,略微下降。与CAPE相比,单糖昔产品 具有优异的抗炎作用,在20gM下对RAW 264.7巨噬细胞的NO, IF・6和TNF- ct抑制率分别为93.4%, 76.81%和56.58%。CAPE与其糖昔对炎症因子分泌的 抑制作用均呈浓度依赖性。
进一步探究了 G-CAPE的抗炎机制。G-CAPE通过作用细胞膜上的TLR4, 阻断受体下游信号通路NF-kB的激活,阻断炎症信号的传导,抑制COX-2和 iNOS炎症介质的表达,从而抑制各种炎症因子的分泌,而展现出抗炎的作用效 果。分子模拟表明,G-CAPE的糖基部分会和MD2的Arg90. Ghi92、Cysl33残 基形成四个氢键,这使G-CAPE与MD2的结合亲和力增强,从而抗炎活性增强。
探究CAPE糖基化反应时间进程,优化CAPE酶法糖基化反应,为得到更 多的G-CAPEo该酶促反应最优的反应温度是30°C,最适合的pH是5.0,最优 的蔗糖浓度是750mMo通过优化得出,为了累积有最好生物活性的G-CAPE的 产量,可以控制反应条件为最优(30°C、pH5.0、750mM蔗糖)酶催化CAPE22〜24h, 处理反应液,萃取收集产物,并用柱层析法分离纯化产物。
本研究通过右旋糖酹蔗糖酶对CAPE糖基化,改善了抗炎药物CAPE应用 中的一些缺陷,产物G-CAPE的抗炎活性显著提高,证明了生物糖基化是改善天 然化合物用于治疗药物开发的生物活性和物理化学性质的有效策略。进一步研究 Y G-CAPE的抗炎机制,对抗炎药物的研发有重要意义。

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